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研究背景

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞在治疗恶性肿瘤，特别是非实体瘤方面表现出显著的疗效。

CAR-T细胞已被证明是一种新型的“活体”疗法，它利用病人的免疫系统来识别特定的肿瘤相关抗原，并将工程化的T细胞重新定向到更有针对性的肿瘤细胞。

体外评估CAR-T细胞的生物功能通常涉及一系列劳动密集型的共培养实验和免疫测定，并且在验证新的CAR-T细胞的过程中，重复性常常受到供体之间的差异和其他影响而不稳定。

为了解决这一挑战，研究学者们提出了CAR-T靶向的荧光素酶报告癌症细胞，这些细胞具有CD19、CD20和HER2的高内源表达，并且表现出敏感和稳定的荧光素酶表达报告，使您能够实时监测候选CAR-T效应细胞在细胞毒性和细胞活力测定中的效力和功效，从而实现免疫治疗突破。

解决思路

基于CAR-T细胞的疗法已成为治疗特定白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的一种有前景的免疫疗法。

在这种治疗难治性癌症的令人兴奋的方法中，通过单采从患者血液中分离T细胞，然后将这些细胞与细胞因子白介素2和抗CD3抗体一起孵化以刺激增殖。将参与移植物排斥反应的基因进行离体沉默，改善了输注后T细胞的稳定性。一旦扩增，适当的CAR通过逆转录病毒转导被引入细胞中。然后这些有效的CAR-T细胞被输回病人体内，使其对肿瘤细胞发挥细胞毒性作用¹。

目前在开发新的CAR结构方面已经投入了大量的研究工作，以增加目标癌症类型的范围并提高其抗肿瘤的疗效。CAR-T发展过程中的一个瓶颈是评估CAR-T细胞的生物功能。以往的经验中，会使用放射性⁵¹Cr释放测定法，但是该方法只能在单一时间点获得数据，且具有内在的放射性，试剂的半衰期、保护措施和废物处理都是关键因素。

研究CAR-T效应功能的一种方法是生物发光（BLI）报告试验，这种方法消除了⁵¹Cr释放和染料负载测定的担忧。在BLI报告基因测定中，将构成性表达荧光素酶的靶细胞与候选效应细胞共同培养，并通过BLI信号的损失来监测细胞

毒性⁴。除了易于使用外，BLI试验中表达荧光素酶的靶细胞可以提高实验间的可重复性。

为了生成CAR-T靶向荧光素酶报告细胞，研究者们将Lenti-LUC2荧光素酶报告剂引入亲代细胞系，进行抗生素选择和单细胞分选，分离出具有高荧光素酶表达的稳定克隆。

然后通过比较低通量和高通量报告细胞，验证目标抗原和荧光素酶的表达稳定性。一旦选择了稳定的克隆并验证了抗原和荧光素酶的表达，报告细胞系就会用尝试过的鉴定方法，如短串联重复（STR）分析、支原体检测以及细胞生长速度和形态学检测，对其进行特征分析和鉴定。

CAR-T靶向荧光素酶报告细胞的性能在T细胞共培养实验中得到了验证。研究者们采用了市售的针对CD19、CD20和HER2的CAR-T细胞，将来自同一供体的空载体转导的T细胞与之配对作为对照。CAR-T细胞对目标肿瘤细胞的细胞毒性是用荧光素酶测定法、市售的效力测定法以及明场和荧光活细胞成像测定法来测量的。

研究者们的结果表明，荧光素酶报告系统是测量癌症和T细胞体外共培养物中生物过程的一种简单、强大和高度敏感的手段。

总之，来自ATCC的CAR-T靶向荧光素酶报告细胞是研究CAR-T生物功能和验证用于癌症免疫治疗的新CAR-T药物的特征鲜明、重复性高的工具。

图1：CAR-T靶向荧光素酶报告细胞。示意图显示表达CD19+WIL2-S-Luc2和Raji-Luc2、CD20+Daudi-Luc2和Farage-Luc2以及HER2+BT-474-Luc2的CAR-T靶细胞分别被CD19、CD20和HER2靶向的CAR-T细胞包围并攻击。

新产品的诞生

目前，ATCCT推出的CAR-T靶向荧光素酶报告细胞产品如下：

这些方便的报告标记细胞可以消除涉及放射性或荧光染料标记的工作流程，使细胞保持靶抗原和荧光素酶的高表达，最高可达到30个群体倍增。这些灵活的靶细胞也可以被纳入其他免疫肿瘤学应用中，如ADCC和自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性试验。

• 靶抗原和荧光素酶的高表达稳定性

• 高信噪比（S/N）

• 生理相关的低E:T比率

• 高效能、完全认证的细胞系

• 易于使用的报告系统

• 可进行实时活细胞成像

主要实验数据

图 2：CAR-T靶向荧光素酶报告细胞可被纳入多种CAR-T疗效检测中。(A）表达CD19的Raji-Luc2细胞（B）WIL2-S-Luc2细胞作为CD19 CAR-T或Mock CAR-T（对照）效应细胞的靶细胞，来自同一供体的效应细胞与靶细胞的比例为所示。加入荧光素酶检测底物，并检测发光信号。信号消失表示细胞死亡；通过CD19靶向的CAR-T细胞的剂量依赖性特异性杀伤大于用模拟CAR-T细胞观察到的非特异性杀伤。此外，用细胞标记染料对Raji-Luc2细胞染色，然后在与CD19 CAR-T效应细胞共培养期间进行实时荧光成像测量。(C）Raji-Luc2细胞（绿色）被效应T细胞包围，与Mock-CAR-T细胞共培养相比，导致荧光下降。(D）在CD19 CAR-T效应细胞共培养6小时和24小时后，研究学者们观察到荧光细胞的数量减少；然而，在与Mock CAR-T细胞共培养时，有许多Raji-LUC2细胞存在。这些结果表明，ATCC CAR-T靶向荧光素酶报告细胞可用于实时评估CAR-T细胞在生物发光实验和活细胞实时成像中的潜力。

图3：HER2 CAR-T对BT-474-Luc2的体外杀伤力检测，使用发光法和xCelligence测量。(A) 将HER2阳性的BT-474-Luc2细胞（5 x 10³）接种到96孔板中，作为同一供体的HER2 CAR-T或Mock CAR-T（对照）的靶细胞，CAR-T细胞与靶BT-474-Luc2细胞分别以不同的比例（1：1，2：1，5：1，10：1）接种。在共培养24小时后，将Bright-Glo加入到指定的孔中。使用发光板阅读器在10分钟内读取板的发光情况，确定HER2 CAR-T细胞具有剂量依赖性的特异性杀伤力，大于用模拟CAR-T细胞观察到的非特异性杀伤力（*=差异明显，ns=差异不明显，使用非配对t检验，单一的集合方差）。(B）HER2 CAR-T细胞以10:1的比例针对2×10⁴HER2阳性的BT-474-Luc2，用xCELLigence系统测量细胞杀伤力。来自同一供体的模拟CAR-T细胞被用作对照。

图4：使用发光和活细胞成像技术对Daudi-Luc2进行CD20 CAR-T体外杀伤试验。(A) 将CD20阳性的Daudi-Luc2细胞（5 x 10³）接种到96孔板中，并用来自同一供体的CD20 CAR-T或Mock CAR-T（对照）的靶细胞，CAR-T细胞与靶Daudi-Luc2细胞分别以不同比例（1：1，2：1，5：1，10：1）接种。在共培养24小时后，在指定的孔中加入Bright-Glo。用发光板阅读器在10分钟内读取板的发光，确定与CD20 CAR-T细胞有剂量依赖性的特异性杀伤，这比用模拟CAR-T细胞观察到的非特异性杀伤要大（*=差异明显，ns=不明显，使用非配对t检验，有一个集合的方差）。(B) 在培养基中存在Incucyte Cytotox红色染料的情况下，将Daudi-Luc2细胞（5 x 10³）与CD20 CAR-T细胞或Mock CAR-T细胞共同培养，并在24小时内每小时测量一次实时荧光成像，结果与CD20 CAR-T共同培养时，荧光强度比与Mock-CAR-T细胞共同培养时增加。(C）与CD20 CAR-T细胞共培养24小时后，与Mock CAR-T细胞共培养相比，Daudi-Luc2显示死亡（红色）荧光细胞数量增加。(D) 对聚集的红色荧光进行了量化和比较（*=差异明显，ns=差异不明显，使用非配对t检验，具有单一合并方差）。

结 论

CAR-T靶向荧光素酶报告细胞在测量靶细胞杀伤方面具有优势，无需使用放射性⁵¹Cr释放试验或预先标记细胞进行CAR-T功能评估⁴。

此外，利用细胞形态学、生长动力学和STR分析对这些报告细胞系进行了表征和鉴定⁷。通过比较低通量和高通量报告细胞，验证了目标抗原和荧光素酶的表达稳定性。

重要的是，这些荧光素表达细胞的细胞毒性可以通过实时的BLI信号损失来测量，这种损失通过活细胞成像和细胞毒性染料吸收试验得到证实。综上所述，特征明确的荧光素酶报告细胞系能够实现方便和一致的信号量化，并且它们是研究CAR-T生物功能和验证用于癌症免疫治疗的新CAR-T药剂的易用工具。这些强大的细胞模型代表了肿瘤学研究中最主要的患者来源的癌和淋巴瘤癌系。

CAR-T靶向荧光素酶报告细胞是从ATCC广泛的已建立的癌症细胞系目录中挑选出来的，这些细胞系含有一些最普遍的癌症抗原的高内源性表达，这使得它们成为开发更合适的CAR-T细胞疗法的更具生理相关性的体外工具。

参考文献：

1. Kiesgen S, et al. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc 16: 1331-1342, 2021. PubMed: 33589826

2. Jackson HJ, et al. Driving CAR T-cells forward. Nat Rev Clin Oncol 13: 370-383, 2016. PubMed: 27000958

3. Sterner RC, Sterner RM. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J 11: 69, 2021. PubMed: 33824268

4. Riss T, et al. Cytotoxicity Assays: In Vitro Methods to Measure Dead Cells, in Assay Guidance Manual. (eds. S. Markossian et al.) (Bethesda (MD); 2004). PubMed: 31070879

5. Meijer TWH, et al. Targeting glucose and glutamine metabolism combined with radiation therapy in non-small cell lung cancer. Lung Cancer 126: 32-40, 2018. PubMed: 30527190

6. Lisby AN, et al. Evaluation of CAR-T cell cytotoxicity: Real-time impedance-based analysis. Methods Cell Biol 167: 81-98, 2022. PubMed: 35153000

7. Capes-Davis A, et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. Int J Cancer 127: 1-8 2010. PubMed: 20143388