小编经常会接到科研工作者关于Addgene质粒如何培养的电话咨询。尤其，很多人是第一次收到从美国漂洋过海后，终于等来的质粒。关于Addgene推荐什么方法来复苏收到的穿刺菌的问题，快来看看Addgene的权威说明。

常见问题&FAQ

• 如何复苏穿刺菌？
• 为什么一定要挑取单克隆菌落？
• 如何划线培养？

下面这个视频中就这些问题做了详细的说明。赶快点击视频学习吧！别忘记了把好东西分享哦！

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为什么一定要挑取单克隆？

当从甘油保存的细菌或者穿刺菌中复苏细菌时，从琼脂板上挑取单菌落再液体培养显得尤为重要。

为什么呢？由于甘油菌或穿刺菌中的大多数细菌细胞在遗传上应该是相同的，但是偶然情况下，会存在个别隐藏的突变细菌。如果你只是简单的从混合菌落中挑选了一团细菌，然后在液体培养基中培养，那么突变的细菌就有可能会接管整个培养物，从而影响您的实验。我们可以通过划线挑选单个菌落的方式来解决问题。在这种情况下，每个单独的菌落就是单克隆，即它们在遗传学上是相同的。使用这些单克隆菌落形成的液体培养物，将会获得预期的质粒产率并在后期试验中获得更一致的结果。

划线前需要准备的材料

• 在正式开始培养前，我们需要收集一些必要的材料。
• 首先是含有你感兴趣质粒的甘油菌或穿刺菌；
• 其次是含有合适抗生素的LB琼脂平板；
• 无菌的牙签或者无菌的接种环；
• 酒精灯或其他火焰；
• 30或37摄氏度的干燥培养箱；
• 最后是良好的无菌操作技术。

划线培养方法

首先，我们取出含有适当抗生素的LB琼脂平板，确保平板上没有污染并且干燥。如果平板上有水珠，你可以把它打开然后放在火焰下约10分钟来风干。接下来，我们要看一下我们的穿刺菌，确保其中有可见的细菌生长。然后取一个无菌的牙签，把它插入并接触到有细菌生长的穿刺区域，这个过程也可以是将无菌的牙签浸入到半融化的甘油菌当中。请注意的是，在牙签上你不需要看到肉眼可见的一团细菌，看起来很干净的牙签表面可能已经被细菌充分覆盖了。

用牙签轻轻地从平板的边缘附近开始划线，牙签与平板接触角度大概在45度左右。请注意一定要轻轻的划线，不要用牙签刺破平板，否则你就会在划线过程中将琼脂翘起来。在划线时要遵循一定的路径，并且需在每个新路径开始时用一根新的无菌牙签。用第一根牙签划线时，我们需要轻轻地连续划线大约至1/3平板大小，并注意避免碰到平板的边缘。扔掉第一根牙签，并转动平板，然后使用一根新无菌牙签从上一次结束的地方开始连续划线约 1/3区域，并在靠近边缘的地方结束。最后，我们用第三根牙签再重复一次这一过程。尽管，这个过程会很快，我们仍需要很细心。

需要确保在培养之前平板是完全干燥的。这是由于，如果细菌在平板上是一层液体的话，它们有可能会在平板上扩散并形成一层菌群而不是单个的菌落。需要注意的是，要将平板倒置放入培养箱中，以避免冷凝的液体会滴到菌落上而干扰它们的生长。现在我们已经完成了划线，我们将平板倒置放入培养箱中过夜或者至少培养12小时。你可以看到我们精心划线后会有单个菌落出现，之后就可以挑取单个菌落以便用于下游各种各样的实验。

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